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Qi
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翊竑
#肿瘤#
工程化T细胞以表达靶向谱系限制性抗原的嵌合抗原受体（chimericantigenreceptor,CAR）作为治疗B细胞恶性肿瘤的有效工具，然而在实体瘤中却疗效不佳。造成这种情况的原因主要是由于肿瘤部位的低效运输和浸润、抑制信号的存在以及肿瘤限制性抗原的缺乏。了解CAR-T细胞识别肿瘤的决定因素有助于克服耐药性问题。与健康细胞相比，肿瘤细胞表现出异常的糖基化，这种“涂层”可能通过掩盖免疫细胞的新表位或干扰其功能，对抗肿瘤反应产生负面影响。增加的β1-6N-聚糖支链是癌细胞中最常见的变化之一，这种修饰是由甘露糖苷乙酰氨基葡萄糖转移酶5（MGAT5）编码的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V活性增加所致。MGAT5的表达受到Ras-Raf-Ets信号通路的正向调节，该通路通常在肿瘤中发生改变，并直接导致肿瘤生长、侵袭和转移，且MGAT5聚糖产物已在乳腺癌和结直肠癌中被认为与生存率降低和预后不良相关。
先前已经开发了一种特异性针对CD44的异构体6（CD44v6）的CAR用于治疗急性髓性白血病和多发性骨髓瘤，最近也被证明在肺癌和卵巢癌的异种移植模型中有效，为更广泛地开发实体瘤治疗提供了机会。由于糖基化是最常发生的蛋白修饰之一，因此可能与调节CART细胞活性的因素密切相关，但CART细胞对实体瘤疗效的临床前评估通常没有考虑到这一特征。
近日，来自意大利IRCCS圣拉斐尔科学研究所的MonicaCasucci团队在ScienceTranslationalMedicine杂志上发表了一篇题为DisruptingN-glycanexpressionontumorcellsboostschimericantigenreceptorTcellefficacyagainstsolidmalignancies的文章，研究人员通过在胰腺癌（pancreaticadenocarcinoma,PAC）中敲除MGAT5，发现N-聚糖通过干扰适当的免疫突触形成和减少转录激活、细胞因子产生和细胞*性来保护肿瘤免受CART细胞杀伤。通过葡萄糖/甘露糖类似物2DG来抑制N-聚糖合成，会引起PAC不同异种移植小鼠模型中的CART细胞活性增强，导致肿瘤浸润性CART细胞耗竭曲线降低。2DG和CART细胞的联合疗法对除PAC之外的多种癌症有效。总之，这项研究表明肿瘤N-糖基化调节CART细胞的反应强度，为合理设计针对实体恶性肿瘤的疗法提供了机会。
为了解析N-聚糖在PAC肿瘤中的影响，研究人员首先分析了参与N-聚糖合成的糖基转移酶的突变负荷情况。来自cBioportal的19%患者的基因组携带糖基转移酶突变且与不良结局相关，其中大多数改变为扩增类型，引起癌细胞中支链N-聚糖丰度更高。此外，来自TCGA的PAC样本RNA测序数据显示N-糖基转移酶表达显着增强。其中，MGAT5对支链N-聚糖的生物合成至关重要，并导致众所周知的伴随恶性转化的β1-6GlcNAc支链增加。于是研究人员构建了MGAT5缺陷的T3M-4PAC细胞，以及特异性靶向CD44v6（44v6.28ζ）或对照CD19（19.28ζ）CART细胞。研究人员发现，阻断T3M-4PAC细胞中的支链N-聚糖表达能显着增强CART细胞的抗肿瘤功效，包括细胞溶解活性、IFN-γ和TNF-α增加等。
免疫突触（immunologicalsynapse,IS）可预测CART细胞的抗肿瘤活性，通过评估CART细胞与MGAT5缺陷的T3M-4PAC细胞或野生型细胞之间形成的IS情况，作者发现MGAT5敲除细胞可以与44v6.28ζ细胞形成更佳的IS。而IS强度决定了T细胞活化的程度，于是作者利用被转导以表达44v6.28ζ或19.28ζ的三重参数报告（TPR）Jurkat细胞，并用野生型或MGAT5缺陷的T3M-4PAC细胞刺激并分析细胞内信号事件。结果显示，N-糖基化缺陷型肿瘤在44v6.28ζ+TPRJurkat细胞中诱导了更强的钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子（NFAT）和NF-κB信号（图1）。
图1.消除MGAT5N-聚糖产物可提高T细胞活化程度并改善CAR信号传导
基于上述结果，可以推断出支链N-聚糖对CART细胞靶向肿瘤的负面影响。那么如果通过药物抑制支链N-聚糖的表达是否可以消除这种影响呢？为此，作者使用葡萄糖/甘露糖类似物2DG处理T3M-4PAC细胞，单独使用2DG治疗不会显着干扰肿瘤细胞增殖或存活，但与44v6.28ζ细胞联合治疗可以有效杀死这些癌细胞。那么这种效应是由抑制N-糖基化还是糖酵解途径介导的呢？作者在共培养时，分别补充葡萄糖或甘露糖，只有甘露糖能阻断2DG处理的影响，因而表明抑制肿瘤糖基化是主要的潜在作用机制。
接下来，研究人员在PAC的异种移植小鼠模型中验证2DG联合44v6.28ζ细胞治疗对肿瘤的控制情况。在低肿瘤负荷的情况下，无论有无2DG均可以实现肿瘤控制，但在高肿瘤负荷模型中，仅联合治疗才能发挥有效的控制作用，且疗效的提高与减少肿瘤浸润44v6.28ζ细胞的耗竭有关。此外，作者观察到表达一种或多种抑制性受体的细胞频率显着降低，如TIM-3和PD-1。这是否意味着2DG诱导的肿瘤细胞去糖基化能直接阻碍PD-1-PD-L1相互作用？来自PD-L1+T3M-4细胞表面蛋白的蛋白质印迹生物素化测定显示，用2DG处理后PD-L1分子量发生显着变化，PD-L1+T3M-4细胞与重组人PD-1的结合能力显着降低。这些发现表明，与2DG的组合不仅可以提高肿瘤清除率，还可以使CART细胞逃避免疫检查点抑制。
图2.2DG处理可以增强胰腺癌细胞对CART的易感性并能显着降低PD-1-PD-L1结合作用。
为了检查联合疗法的普遍性，作者筛选了源自不同人类癌症的一组细胞系中的N-聚糖表达。植物血凝素-L（PHA-L）结合分析显示，除了PAC，来自肺和膀胱的肿瘤也表达N-聚糖，与2DG的组合显着增加了对仅靠44v6.28ζ细胞难以靶向的高度糖基化肿瘤的杀伤。为了扩大对多种肿瘤治疗潜力的评估，作者使用了膀胱癌和卵巢癌细胞模型和肿瘤异种移植模型，可以达到与上述利用PAC细胞验证实验一致的结果。需要注意的是，在再次用肿瘤攻击小鼠后，联合治疗能有效引发记忆反应，且能分离高比例的早期记忆T细胞，表明联合治疗具有长期防止肿瘤复发的能力。最后，研究人员还检查了去除N-聚糖是否对CD44v6以外的CAR有益，于是他们构建了经过改造以表达CD28共刺激的靶向癌胚抗原的CAR（CEA.28ζ）。糖基化的T3M-4PAC细胞对CEA.28ζ细胞具有高度抗性，但敲除MGAT5显着增强了肿瘤消除率和T细胞活化程度。不仅如此，CEA.28ζ细胞和2DG的组合也对包括肺癌和膀胱癌在内的其他癌细胞系有效，进一步证实了这种方法具有广泛适用性的潜力。
总的来说，这项研究证明，细胞外N-聚糖通过增加CART细胞活化阈值和促进CART细胞耗竭提供了有效的肿瘤抗性机制，而将2DG与CART细胞联合使用可以打破这种屏障，恢复几种恶性实体瘤对CART细胞靶向治疗的易感性。虽然每个特定的肿瘤适应症肯定需要专门的药代动力学和药效学研究，但这些结果支持2DG和CART细胞联合可以作为一种有效工具来改善对单独的CART难治性实体瘤的治疗效果。
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