百趣生物iTRAQ/TMT标记定量蛋白质组研究是对一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂混合体系内所有蛋白质进行标记，利用标记试剂中的二级报告离子来对蛋白进行精确鉴定和定量。接下来就跟着阿趣一起解读吧。
文章标题：Profilin1InducesTumorMetastasisbyPromotingMicrovesicleSecretionThroughtheROCK1/p-MLCPathwayinNon-SmallCellLungCancer
发表期刊：FrontiersinPharmacology
发表时间：.5
影响因子：5.
合作单位：医院
百趣生物提供服务：TMT标记蛋白组
01摘要
Profilin1(PFN1)是一种肌动蛋白结合蛋白，在几种癌症的转移中发挥着不同的作用；然而，其在非小细胞肺癌(NSCLC)转移中的作用仍不清楚。作者应用TMT标记定量蛋白组技术研究其诱导肿瘤转移的机制。蛋白质组学分析显示PFN1参与微泡(MV)分泌。与非转移性NSCLC患者的血清相比，转移性NSCLC患者的血清中MV的丰度增加。体外和体内实验均表明，PFN1可以增加MV分泌，并且源自PFN1过表达细胞的MV显著促进NSCLC转移。同样发现PFN1可以与ROCK1相互作用并增强其激酶活性以促进肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化从而促进MV分泌。ROCK1的抑制降低了MV的分泌并部分逆转了PFN1诱导的NSCLC转移的促进作用。总的来说，这些发现表明PFN1调节MV分泌以促进NSCLC转移。PFN1和MV代表了NSCLC转移的潜在预测因子或治疗靶点。
02实验结果
1.PFN1与NSCLC转移相关，可促进NSCLC细胞体外迁移
为了研究PFN1在NSCLC中的作用，作者采用IHC方法、组织芯片定量等实验，表明了PFN1参与了NSCLC的转移，并构建细胞系，通过RT-qPCR和Western检测过表达和敲除的影响，后又采用伤口愈合和Transwell迁移试验来确定PFN1对迁移的影响。
图1.NSCLC组织PFN1的IHC分析图像/Kaplan–Meier生存分析
2.PFN1可促进NSCLC中Mv的分泌
为了进一步研究EV和PFN1OE细胞之间的分子差异以及影响NSCLC的可能信号通路。作者利用基于蛋白质组学的方法（TMT定量蛋白质组学）描述它们之间的蛋白质水平。差异蛋白质（DEPs）筛选条件为P值0.05和倍数变化≤0.83或倍数变化≥1.2。结果确定了个差异蛋白质，其中个上调的蛋白质和个下调的蛋白质（图2）。
图2.差异表达蛋白分析热图
接下来，利用富集分析来确定这些DEPs是否可以指向任何特定的生物学功能，从而可以深入了解它们在生物学功能上的差异。GO注释表明DEPs涉及蛋白质结合、细胞成分组织或生物发生和细胞器组织（图3）。大多数不同表达的蛋白与细胞器相关，这与PFN1在细胞膜运输中的作用相一致。同源蛋白群簇(COG/KOG)分析显示，DEPs参与了翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣蛋白、细胞内运输、分泌、囊泡转运和信号转导机制（图4）。通过蛋白质组学分析，我们推断PFN1可能通过蛋白相互作用和信号转导参与细胞外囊泡分泌，进而促进NSCLC转移。
图3.差异表达蛋白的GO富集分析
图4.差异表达蛋白的COG／KOG分析
由于PFN1在细胞膜运输中起着重要作用，而MVs是癌症转移的关键介质，我们从临床样本的血清中提取了细胞外囊泡(MVs和外泌体)。通过一系列实验，发现PFN1可能调控MLC的磷酸化，而磷酸化可以调节MV的分泌。
3.来自PFN1OE细胞的MVs促进了NSCLC细胞的迁移
Mv是癌症转移的关键介质。作者收集了转移性（n=25）和非转移性（n=20）肺癌患者的血清样本，并提取了Mv（图5）。作者通过一系列过表达，以及伤口愈合和Transwell迁移实验，发现PFN1可能通过诱导MV分泌促进NSCLC转移。
图5.为确定PFN1在肿瘤转移中的作用而建立的转移瘤小鼠模型示意图
4.PFN1通过提高MV的分泌来促进体内NSCLC的转移为了进一步研究PFN1在NSCLC转移中的作用，我们通过心内注射HNSCLC细胞建立了肿瘤转移的小鼠模型，结果进一步证实了PFN1在NSCLC转移中的作用（图6）。
图6.HE染色小鼠模型肺组织的代表性图像/肺组织中PFN1和p-MLC表达
5.PFN1促进MLC磷酸化的机制作者通过敲低、过表达、co-IP、Westernblot、免疫荧光、流式细胞术等实验，发现PFN1可以与ROCK1相互作用，增强其激酶活性，并间接促进MLC磷酸化，最终诱导MV分泌。ROCK1抑制剂Y部分逆转了PFN1促进MLC磷酸化和MV分泌的作用（图7）。
图7.western印迹法测定PFN1过度表达(A)/敲除(B)后的蛋白表达/PF
6.ROCK1抑制剂Y在体内和体外均部分逆转了PFN1对NSCLC转移的影响创面愈合实验显示（图8），Y处理的过表达PFN1的细胞迁移减少到接近EV细胞.接下来，将过表达PFN1的细胞来源的MVs添加到y处理的细胞中，发现Y并没有逆转过表达PFN1的细胞来源的MVs诱导的迁移，从Transwell迁移实验中也得到了类似的结果，此外也用小鼠模型验证了这些结果。
图8.伤口愈合实验评估Y的疗效
03总结
研究结果表明，PFN1是关键的肌动蛋白调节蛋白，调控肌动蛋白细胞骨架的关键蛋白之一，它通过ROCK/p-MLC通路促进MV的释放，从而促进NSCLC的转移。因此，PFN1可能是NSCLC转移的潜在治疗靶点。通过减少MVs的释放，有可能会部分逆转PFN1过表达诱导的NSCLC细胞迁移。本研究为靶向转移治疗NSCLC提供了一种潜在的新方法，值得进一步研究。
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文/阿趣代谢组学