肝细胞癌是最常见的原发性肝癌，而作为肝癌大国，有超过50%的新发肝癌发生在我国。索拉非尼是首个FDA批准的用于晚期肝细胞癌靶向治疗的药物。但由于肝癌的发生发展机制复杂且异质性大，在接受索拉非尼治疗6个月后，大多数患者会对索拉非尼产生耐药性，使得疾病进一步恶化，给治疗带来了巨大的困难。
来自浙江大学医院的蔡秀*教授团队，致力于肝癌的临床与基础转化研究，近日在肝癌靶向治疗耐药领域获突破性进展。研究团队阐述了circRNA-SORE(acircularRNAupregulatedinsorafenib-resistantHCCcells）介导索拉非尼耐药的机制，同时发现了调控circRNA-SORE表达水平的表观遗传学机制。该研究以题为“N6-methyladenosine-modifiedcircRNA-SOREsustainssorafenibresistanceinhepatocellularcarcinomabyregulatingβ-cateninsignaling”的文章，刊登在BMC出版集团旗下的肿瘤学权威学术期刊《MolecularCancer》（IF=15.）上。
图1.机制展示
研究数据表明，circRNA-SORE可作为ceRNA（竞争性内源性RNA），通过吸附miR-a-2-5p和miR--3p，从而竞争性激活Wnt/β-catenin途径来诱导索拉非尼耐药。更重要的是，团队发现circRNA-SORE中特定腺苷的N6-甲基腺苷（m6A）水平升高有助于维持其RNA的稳定性，继而使circRNA-SORE的含量升高，促进了耐药的产生。本研究在国际上首次提出circRNA上特定位点的m6A修饰可通过RNA稳定性影响其表达水平，是对肝癌表观遗传学分子机制的创新性探索，阐述了肝癌靶向治疗耐药性产生的新机制，为寻找晚期肝癌病人新型治疗靶点提供新的线索。
图2.circRNA-SORE在索拉非尼耐药肝细胞肝癌中明显升高，
并且在耐药性的维持中发挥重要意义
研究团队首先在前期的研究中建立了索拉非尼耐药的肝癌细胞系，并找到了在耐药形成过程中扮演重要角色的circRNA-SORE。与预期相符的是，circRNA-SORE在索拉非尼耐药的细胞和动物肿瘤中，表达均明显上升，且对于维持索拉非尼耐药性至关重要。在耐药细胞中，沉默circRNA-SORE使得细胞增殖明显减少、凋亡显著增多且克隆形成能力明显下降。研究团队认为，沉默circRNA-SORE主要通过诱导了肿瘤耐药细胞的凋亡，提高了索拉非尼的疗效。
图3.circRNA-SORE作为ceRNA吸附miR-a-2-5p和miR--3p，
竞争性激活wnt/β-catenin途径诱导索拉非尼耐药
CircRNA最常见的作用机制是作为ceRNA，吸附各种各样的miRNA，导致原本与miRNA结合的mRNA的翻译不能被miRNA阻止，形成了mRNA的竞争性激活，从而引起下游蛋白表达水平的升高而产生相应的生理病理表现。那么circRNA-SORE是否也具有miRNA海绵的特性呢？首先，研究团队通过基于TargetScanmiRanda的miRNA结合预测软件，获得了12个预测与circRNA-SORE结合的miRNA，并针对circRNA-SORE进行RNA-pulldown实验分析验证，发现有8个miRNA在circRNA-SORE上有明显的富集，证明circRNA-SORE确实可以扮演了ceRNA的角色。进一步功能实验表明，过表达miR-a-2-5p和miR--3p的mimics后，耐药细胞对索拉非尼的敏感性显著提升。为了探究circRNA-SORE调控miR-a-2-5p和miR--3p的具体机制，研究团队首先应用荧光原位杂交技术发现circRNA-SORE与miR-a-2-5p和miR--3p在细胞中存在着共定位，符合两者结合的特征。RNA免疫共沉淀显示进一步提示miR-a-2-5p和miR--3p可与circRNA-SORE相结合。circRNA-SORE与Ago2的结合在耐药株中更容易被检测到，进一步提示了circRNA-SORE作为ceRNA功能的特性。针对circRNA-SORE上特定位点突变的双荧光素酶报告试验进一步提示了circRNA-SORE与miR-a-2-5p和miR--3p的结合。circRNA-SORE结合miR-a-2-5p和miR--3p后又是如何调控索拉非尼耐药的表型呢？在肝癌中，wnt/β-catenin通路起到十分关键的作用，而研究团队发现，耐药细胞中β-catenin的蛋白水平明显高于野生细胞，且其表达量与circRNA-SORE的表达水平呈正相关。进一步实验证明，耐药细胞中的β-catenin及其上游wnt2b的蛋白水平均受到circRNA-SORE以及miR-a-2-5p和miR--3p的调控，并且相应的表型实验结果均与调控方向相符，说明circRNA-SORE调控的这两个miRNA的下游很有可能就是wnt/β-catenin信号通路。基于这个假设，研究团队针对wnt2b的mRNA与miR-a-2-5p及miR--3p的结合位点预测，并进行位点突变前后的双荧光素酶报告实验。系列结果显示，miR-a-2-5p和miR--3p可与wnt2b的mRNA3’UTR区结合，促进了mRNA的降解，从而抑制了wnt2b/β-catenin信号通路。
至此，研究团队通过实验证明了circRNA-SORE以ceRNA的角色吸附隔离miR-a-2-5p和miR--3p，竞争性激活了wnt/β-catenin信号通路，诱导并维持了肝癌对索拉非尼的耐药。
图4.CircRNA-SORE与m6A的关系，
以及circRNA-SORE在动物模型中扮演的角色
在非编码RNA的研究中，引起RNA表达异常的原因始终是困扰众多研究者的问题之一。m6A是RNA修饰中最为丰富的一种，研究者不断地发现RNA的m6A修饰在肿瘤的进展中扮演重要功能，而近年来研究者发现，circRNA的m6A修饰（常发生在RRm6ACH模体上，R?=?GorA;H?=?A,CorU）可对其功能产生调控作用。circRNA-SORE上是否存在m6A修饰？m6A修饰在其中会扮演什么样的角色？带着前沿问题，研究团队首先通过SRAMP和RMBasev2.0数据库预测，发现位于circRNA-SORE序列的juction位点附近存在一个极有可能被m6A修饰的位点。RNAPulldown试验表明，circRNA-SORE可与YTHDF1、YTHDF2、METTL3和FTO这些m6A相关的酶蛋白来相结合，提示circRNA-SORE可能被m6A调控。甲基化RNA免疫共沉淀(methylatedRNAImmunoprecipitation,meRIP)实验表明，耐药细胞中circRNA-SORE的m6A修饰水平较野生细胞增高。研究团队进而对m6A修饰相关蛋白进行沉默发现，敲减METTL3和METTL14后，circRNA-SORE的m6A修饰水平显著下降，而敲减FTO后，其修饰水平显著升高，提示了circRNA-SORE上m6A修饰位点的存在。一系列实验表明，circRNA-SORE不仅被m6A修饰，其表达水平也受到m6A修饰水平的调控。然而，目前仍不确定的是，这种调控作用是在整体m6A水平上，还是特定位点的m6A水平上？为了回答这一问题，研究团队进行了进一步探究，设计了一套针对circRNA-SORE中m6A位点的序列特异性吗啉代反义寡核苷酸（MAO）。与对照MAO（MAO-NC）处理的细胞相比，在用MAO靶向circRNA-SORE（MAO-SORE）处理的HepG2-SR细胞中，m6A水平显着降低。更令人兴奋的是，研究团队采用了最新的CRISPR-Cas9-ALKBH5复合物对m6A位点进行定点去甲基化技术，进一步证实了circRNA-SORE上存在预测的m6A位点，而将m6A位点突变的后，circRNA-SORE的m6A修饰水平明显降低。
相关研究表明，m6A修饰涉及转录后RNA代谢的所有方面，包括mRNA定位，剪接，翻译和降解，进而调节重要的生物学过程。研究团队发现，沉默腺苷甲基转移酶METTL3/14可降低circRNA-SORE的水平。值得注意的是，MAO-SORE可以降低耐药细胞中的circRNA-SORE水平，但不能降低野生细胞中的circRNA-SORE水平，进一步提示m6A修饰可能促进circRNA-SORE在耐药细胞中的上调。有趣的是，应用放线菌素D的RNA稳定性试验表明，在耐药细胞中，MAO-SORE降低了circRNA-SORE的稳定性，同时野生型circRNA-SORE比m6A位点突变的circRNA-SORE更稳定。这些结果表明，m6A修饰可能通过增加circRNA-SORE的稳定性来调节其表达。最后，研究团队利用构建的CDX小鼠肝癌成瘤模型及其对应的索拉非尼耐药模型，在体内水平证实了circRNA-SORE可以通过wnt/β-catenin途径来诱导索拉非尼耐药。综上，综上，研究团队发现m6A修饰的circRNA-SORE在肝癌索拉非尼耐药形成过程中发挥了重要的作用。本研究设计严谨、思路新颖，为肝细胞肝癌的临床诊疗提供了新的思路。蔡秀*教授是论文的通讯作者，徐俊杰博士后为论文的第一作者。该项研究受到国家重大科研项目、国家自然科学基金项目、浙江省重点研发计划、中国博士后科学基金项目、浙江省自然科学基金等资助。
通讯作者：蔡秀*教授主任医师、博士生导师、FACS、FRCS
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