摘要
医院胸外科*团队和清华大学医学院生物医学工程系郭永团队合作，在《OncoTargetsandTherapy》发表题为"HighlySensitiveDropletDigitalPCRMethodforDetectionofdenovoEGFRTMMutationinPatientswithNon-SmallCellLungCancer"的研究论文，该研究使用新羿TD-1数字PCR平台，验证了非小细胞肺癌病人中原发EGFRTM突变与共存的致敏EGFR突变在等位基因上的顺反式关系（顺式排列指两个位点在同一条DNA分子上，反式排列则是指两个位点不在同一条DNA分子上，这两种不同排列方式导致患者对药物的敏感性不一样），并探索了福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本对检测原发EGFRTM突变的影响。
方法与结果
该研究入组了例中国非小细胞肺癌患者，所有病人都未使用过EGFR-TKIs。对于前例患者（A组），通过外科手术获取肿瘤组织后快速冷冻后保存于-80℃；对于后50例患者（B组），获取病人的肿瘤组织和癌旁正常组织，并分别制作成冰冻肿瘤组织、FFPE肿瘤组织、冰冻正常组织和FFPE正常组织。对A组的例冰冻肿瘤组织进行EGFR基因突变检测，并对同时检出TM突变和致敏EGFR突变的样本进行等位基因顺反式检测。对B组的4种类型样本进行EGFR基因突变检测，分析4种类型样本中TM突变比例。（详细流程见图1）
例冰冻组织EGFR检测结果如下表：
图1研究设计流程
对3例为LR+TM双阳性样本。进一步构建了LR+TM双重检测体系，用总RNA分析LR和TM的顺反式关系，结果表明，这3例样本均为顺式关系，即LR和TM突变存在于同一条DNA分子上（图2）。
图2（A）显示了野生型EGFR的NSCLC细胞系的FAM非特异性信号。（B、C、D）3例NSCLC患者，同时伴有原发TM和LR突变，用ddPCR方法检测两种突变的等位基因关系，B、C、D所示为EGFR的原发TM（FAM标记）和LR（VIC标记）的双阳性信号，FAM和VIC阴性信号以黑色表示。野生型EGFRLR和野生型TM突变的信号以蓝色表示。EGFRLR突变阳性的信号以绿色表示。原发TM伴随顺式LR突变的双阳性信号以橙表示。
对B组的50例病人的4种类型样本进行19Del、LR和TM检测，发现TM在癌旁正常组织FFPE样本的丰度为0.1%-0.5%，而同样的冰冻组织的突变丰度均低于0.1%。这提示在用FFPE样本检测TM突变时，需仔细确认判读的cutoff。
图3FFPE肿瘤组织样本和FFPE癌旁正常组织样本中的原发TM突变丰度
研究结论
1、中国NSCLC原发TM突变发生率很低，在本研究中只有1.3%。
2、本研究发现的3例LR+TM双阳性样本为顺式突变，数字PCR可以有效检出。
3、福尔马林固定造成的人工突变会影响FFPE样本的TM突变检测。所以使用ddPCR检测FFPE样本前，应仔细验证ddPCR检测体系的分析cutoff值。
作者介绍
医院胸外科王迅主治医生为该论文的第一作者，医院胸外科*教授与清华大学医学院郭永教授为论文的合作通讯作者。原文链接：