背景
非小细胞肺癌（non-smallclllungcancr,NSCLC）是肺癌中最常见的类型。表皮生长因子受体（pidrmalgrowthfactorrcptor,EGFR）酪氨酸激酶受体抑制剂（tyrosinkinassinhibitors,TKIs）是目前最重要的靶向治疗药物，对于有EGFR敏感突变的NSCLC，采用EGFR-TKIs治疗能取得明显的临床疗效；TM突变是最常见的EGFR-TKIs耐药机制，通过对外周血进行EGFR基因突变检测，可以筛选出EGFR-TKIs治疗有效或治疗过程中对其产生耐药的患者。其定量分析不仅在肿瘤的早期诊断中具有重要意义，而且是疗效评价及随访的重要生物学指标。目前，用于检测外周血EGFR突变的方法有很多，其中以在数字PCR基础上建立起来的ddPCR灵敏度最高，实现了对样本的高通量检测，定量程度较其他方法更为精确，在临床基因诊断中具有广阔的应用前景。
部分肿瘤细胞从原发肿瘤组织中脱落进入外周血、胸腔积液、唾液、粪便中，称为游离肿瘤细胞，游离肿瘤细胞发生凋亡或肿瘤细胞在原发肿瘤组织中凋亡坏死后均可释放DNA到外周血、胸腔积液、唾液、粪便等部位，这些DNA称为游离DNA（cll-frDNA,cfDNA）。研究证实，释放入外周血的游离肿瘤细胞或游离DNA可一定程度反映肿瘤基因表型。Karlovich等曾采用不同检测方法反复试验后指出组织突变亦存在假阴性的可能，其原因可归结为肿瘤异质性，这在检测耐药突变T79M时更为突出，也间接证明了血浆代替肿瘤组织做为检测EGFR突变样本的优越性。
目前，用于检测外周血EGFR突变的方法有很多，包括测序法、实时荧光定量PCR（ral-timPCR,RT-PCR）、扩增阻滞突变系统（amplificationrfractorymutationsystm,ARMS）、突变富集PCR（mutant-nrichdPCR,ME-PCR）、变性高效液相色谱法（dnaturinghighprformanc1iquidchromatography,DHPLC）及数字PCR等。以上方法各有其优缺点，本文将目前用于检测外周血EGFR基因突变的方法综述如下。
用于检测外周血EGFR基因突变方法的概述
测序法
测序法是目前检测基因突变最基础、应用最广、最直接、最准确的一种方法，不仅能检测已知突变，而且能发现新的突变，且费用不高，是目前公认的检测基因突变的金标准。该方法需要对待测序样品进行扩增、纯化、序列分析，过程繁琐，耗时较长，故在临床应用中存在一定的限制，不适用于大量临床样品分析。更重要的是测序法本身灵敏度不高，仅能检测突变含量在25%-30%以上的样本。因此，对核酸含量较低的外周血来说，其检测效果不佳。由一代测序法即直接测序法发展而来的二代测序，其核心思想为边合成边测序，相比一代测序灵敏度及特异性有所提高，现有的技术平台包括Roch/FLX、Illumina、SolxaGnomAnalyzr和ApplidBiosystmsSOLIDsystm。
RT-PCR
RT-PCR于年由美国ApplidBiosystms公司推出，该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，与常规PCR相比，其特异性更强，自动化程度高，目前已得到广泛应用。实时荧光定量PCR在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现定量功能。其原理为：随着PCR反应的进行，PCR产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加，每经过一个循环，荧光定量PCR仪收集一次荧光信号，这样就可以借助于荧光信号强度来监测PCR产物的变化，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。用荧光定量法检测目的基因并不需要检测突变基因组DNA具体含量，仅需检测样本是否具有扩增信号即可，并且PCR反应具有核酸扩增的高效性，可检测出微小突变。该方法可以检测出含量为1%以上突变。但该技术的定量检测依赖于Ct值（cyclthrshold），而Ct值会受扩增效率的影响，这在一定程度上限制了精确定量检测。
ARMS
年Nwton等在PCR的基础上，建立了AMRS，也称等位基因特异性扩增法（alll-spcificamplification,ASA），或称等位基因特异PCR（alllspcificPCR,AS-PCR）。该技术利用DNA聚合酶缺乏3’→5’外切酶活性，PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，针对不同的已知突变，设计适当的引物以检测出突变基因。该法在设计引物时，在引物3’端设计一错配碱基，一个与野生DNA互补，一个与突变DNA互补，使之仅能与突变型或野生型互补而只扩增突变型或野生型基因。扩增产生的PCR产物可以通过凝胶电泳或是实时荧光定量PCR（ral-timPCR）测定进行分析。ARMS法敏感性可达到1%。蝎形探针扩增阻滞突变系统（ScorpionsARMS,SARMS）则是在扩增阻滞突变系统的基础上，引用了一种新型探针即Scorpions探针，由于Scorpions探针中序列特异性引物和探针在同一分子上，因此信号的产生特别快，其敏感性可达0.1%。Cobas
是以ARMS为检测原理的伴随检验试剂盒，检测EGFR突变的敏感性达0.1%。ARMS的不足之处在于只能检测已知突变。数字PCR
数字PCR的问世给基因分子检测带来了里程碑式的改变，其通过将样品大倍数稀释，使每个细分试样中所含有的待测分子数不超过1个，经PCR扩增后通过基因芯片逐个计数。这是一种绝对定量的方法，可以在大量野生型基因为背景时检测到含量极少的突变，无需校准。近年来，在数字PCR基础之上又衍生出如微乳滴磁珠PCR（BEAMing）、微数字PCR（microfluidicsdigitalPCR）、微滴数字PCR（dropltdigitalPCR,ddPCR）等敏感性和特异性更高、定量更精确、效率也更高的检测方法。BEAMing于年推出，该方法结合了数字PCR与流式技术，通过将引物结合在磁珠表面，再将单个磁珠与目标分子包裹在微乳液滴中进行PCR扩增，将野生型和突变型目标分子在磁珠表面进行复制，扩增结束后进行破乳，再利用流式细胞技术进行荧光计数。其灵敏度高，适合用于低概率的等位基因突变分析，其检测EGFR突变的敏感性达0.02%。微数字PCR是在数字PCR的基础上结合了基因芯片技术，有效避免了交叉污染，操作时间短，可在2h内（仅需20min的人工操作时间）完成12个样品的同步检测，检测灵敏度达0.1%。但由于目前基因芯片技术发展还不甚成熟，其在临床的实际应用程度仍然有限。Bio-Rad公司于年推出了ddPCR系统，该技术在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，可以将每份样本分成20,个微滴，而后进行PCR扩增，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例，可得出靶分子的起始拷贝数或浓度，是一种核酸分子绝对定量技术，其检测敏感性高达0.%。
外周血EGFR基因突变检测
测序法目前被公认为是检测基因突变的金标准，但仅能检测突变含量在25%-30%以上的样本，外周血EGFR突变检出率波动也较大，约在5.1%-37.0%。因此，对于外周血这类cfDNA及肿瘤细胞含量少、野生型占比高的样本来说，测序法并不是最优选择。ARMS法敏感性可达0.1%，但只能检测已知突变。日本学者Kimura等在其两项研究中用测序法和SARMS法分别检测了血清EGFR的两个热点突变，发现采用SARMS法得到的突变率明显高于测序法（48.1%vs37.0%），其灵敏度为50.0%-75.0%，特异度85.7%-97.1%，一致率达72.7%-92.9%；值得一提的是，SARMS法检测得到的血清EGFR敏感突变阳性的患者在接受靶向治疗后，其中位无疾病进展生存期（progrssion-frsurvival,PFS）、总生存期（ovrallsurvival,OS）明显长于突变阴性患者，显示出敏感突变与靶向治疗反应的一致性，而采用测序法则并未得到这一结论。Mahswaran等曾选取20例配对的肿瘤组织及外周血游离肿瘤细胞，其肿瘤组织已知均含有EGFR敏感突变，采用SARMS法对外周血游离肿瘤细胞进行检测，共检测出19例与肿瘤组织相一致的突变，检出率达95.0%；该研究同时比较了12例配对外周血游离肿瘤细胞和血浆cfDNA分别作为样本时在检测EGFR突变方面的优劣，结果提示以游离肿瘤细胞为样本时能更有效的检测出突变（92%vs33%,P=0.）。在IPASS研究中的亚组分析中，曾采用SARMS法对86例血清cfDNA进行EGFR基因突变检测，其灵敏度为43.1%，特异度为.0%，一致率为66.3%。Douillard等采用SARMS法检测了例高加索人种的血浆cfDNAEGFR基因突变，其灵敏度为65.7%，特异度为99.8%，检测一致率达到94.3%。Yung等采用数字PCR对31例血浆进行突变检测，与测序法测得的组织突变结果相比，其灵敏度为91.7%，特异度.0%，一致率高达96.8%；同时，该研究利用数字PCR的定量功能发现对EGFR-TKIs反应较好的患者，其血浆突变基因含量会随着治疗的进行而降低，提示我们对EGFR突变进行定量分析可以指导临床医生做出更好的治疗决策。Zhu等将突变DNA稀释至不同浓度，测得ddPCR敏感性达0.04%；与ARMS法检测得到的组织突变结果比较，其检测血浆cfDNA灵敏度和特异度均较高，分别为81.8%和98.4%。本文作者亦就ddPCR检测血浆cfDNAEGFR两个热点突变的灵敏度、特异度及与组织结果的一致性进行了相关研究，样本例数充足，共检测样本例，得到的结果分别为61.3%、96.7%、81.4%，与Oxnard等得到的结果较为一致。Thrss等在其研究中详细比较了Cobas
、BEAMing及ddPCR检测EGFR两种常见敏感突变的优劣，不管是灵敏度、特异度还是与组织突变结果的一致性方面，三种检测方法均取得了另人满意的结果。其中以BEAMing灵敏度最高，达93%以上，Cobas最低，但也在86%以上，ddPCR居中，为90%；特异性方面，Cobas与ddPCR均达到了%，BEAMing在93%以上；与组织突变的一致率方面，均能达到90%以上，其中以ddPCR最高，达到了97%。Karlovich等在其试验中同样采用Cobas检测血浆ctDNAEGFR敏感突变，其特异度同样达到%，但灵敏度及与组织突变一致率较低，不到80%。表1列出了各研究采用不同方法检测外周血EGFR两种最常见敏感突变数据特点。表1不同方法检测外周血EGFR敏感突变结果
外周血TM突变检测与EGFR-TKIs获得性耐药
在EGFR-TKIs治疗过程中，所有患者最终均会对EGFR-TKIs产生耐药，其中TM突变为最常见的耐药机制，约占所有耐药机制的47%-66%。已有文献报道，TM突变在外周血中的出现要早于影像学进展，最早可在影像学进展前16周在外周血中检测到TM突变的存在。及时对患者的TM突变状态进行动态检测便于临床工作者做出更好的医疗决策，这在实际临床工作中对TM的监测造成了很大限制，并且肿瘤组织有很大的异质性，而以外周血为标本检测TM突变相较肿瘤组织则具备了很多优势。Sornsn等采用ARMS法对TM连续监测发现，其最早在临床出现明显进展前天就已经出现在血浆DNA中。Ishii等将数字PCR用于EGFR-TKIs耐药后TM的检测，其灵敏度达81.8%，特异度85.7%，与组织检测结果一致率为83.3%。Thrss等选取38例样本详细比较了Cobas
、ddPCR、BEAMing在检测血浆ctDNATM突变灵敏度、特异度及与组织的一致率。ddPCR与BEAMing灵敏度及与组织突变状态一致率取得了令人满意的结果，在70%以上，Cobas灵敏度仅为41%，与肿瘤组织一致率不足60%。而在Karlovich的研究中，Cobas检测TM的灵敏度及与组织突变的一致率均有所提高，分别为63.3%和86.3%。Thrss等进一步选取了72例样本对比了Cobas与BEAMing检测血浆ctDNA的优劣，二者灵敏度均另人满意，但BEAMing稍高于Cobas（81%vs73%），但BEAMing检测TM的特异性不及Cobas（58%vs67%）；二者检测TM的一致率高达90%；该研究同时指出，同样经过AZD治疗的患者，采用Cobas测得的组织TM突变阳性患者的客观缓解率与经同样方法测得的血浆阳性患者一致。以上均说明了Cobas和BEAMing可以用于检测血浆是否含有TM突变。从以上各学者的研究中可以看出，与非数字化试剂盒相比，数字化试剂盒对游离DNATM的检测更具优势，其灵敏度更高。Zhng等采用ddPCR对EGFR-TKIs耐药后的25例血浆ctDNA进行TM突变检测，灵敏度81.0%，特异度.0%，组织突变一致率88.0%。总结
如何快速简便高效的筛选出EGFR突变是当下基础科研人员及临床医生共同关心的问题。目前还没有一种完全适用于临床的标准统一的检测外周血cfDNA及游离肿瘤细胞EGFR基因突变的方法。
数字PCR及在此基础上建立起来的BEAMing、微数字PCR、ddPCR及伴随诊断试剂盒Cobas
，实现了对样本的高通量定量检测，尤其是ddPCR，其灵敏度极高，可检测出含量为0.%的突变，而且省时，3h可以对96份样本进行结果判读，且定量程度较其他方法更为精确，这对于靶向药物治疗后疗效评估及耐药机制研究来说十分重要，相信其在临床基因诊断、第三代EGFR-TKIs作用机制研究中将会呈现无可比拟的优越性。信息来源
ZhangY,XuY,WangM.RsarchAdvancmntonEGFRMutationDtctionofCll-frDNAandTumorCllinPriphralBloodofPatintswithNon-smallCllLungCancr.CJLC.Nov20;19(11):-
靶向分子诊断