——声明：仅供医疗专业人士参考
编者按：表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（epidermalgrowthfactorreceptor-tyrosinekinaseinhibitors,EGFR-TKIs）已经成为晚期非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancer,NSCLC）的有效靶向治疗药物，对于携带EGFR突变的患者能够显著降低疾病进展或死亡风险，改善患者生存质量。然而，绝大部分EGFR基因突变的NSCLC患者在接受EGFR-TKI治疗后会发生耐药，而50%-60%患者的耐药机制是由于EGFRTM位点发生了突变。因此EGFR-TKI治疗耐药后尽早进行TM突变检测对后续治疗策略的制定至关重要。但是当患者发生EGFR-TKIs耐药时，病情往往出现了进展，手术样本或穿刺样本会更难获得，此时该如何检测EGFR基因TM突变？为此，智慧病理网邀医院病理科李青主任来探讨如何用血浆样本解决耐药后患者样本获取困难的问题，同时探讨耐药后血浆游离DNAEGFR基因TM突变的正确检测方法和临床意义。
专家介绍
李青
科主任，主任医师，硕导，省重点学科带头人
中国抗癌协会肿瘤病理专委会骨和软组织肿瘤/肿瘤性心脏病学组委员
医院协会病理专业委员会原发不明肿瘤学学组委员
中国老年学和老年医学学会精准医疗分会常务委员
中国医疗保健国际交流促进病理学会委员
江苏省医学会病理专业委员会委员/分子学组委员
江苏省抗癌协会病理专业委员会常委/淋巴瘤/胰腺病专业委员会委员
医院学会分子及数字病理专业委员会副主任委员
江苏省病理质控中心委员
江苏省医师协会病理专业委员会委员
江苏省转化医学分会遗传与免疫学组委员
常州市医学会病理分会主任委员
常州市病理医疗质控中心主任委员
医院协会病理质量管理专业委员会主任委员
非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药后血浆游离DNAEGFR基因TM突变的分析
血浆游离DNA分析为较难通过手术或穿刺获得肿瘤组织的耐药患者提供了新的样本来源
肺癌是全球范围内病死率最高的恶性肿瘤，非小细胞肺癌约占所有肺癌亚型的80%-85%。使用酪氨酸激酶受体抑制剂（TKI）对具有驱动基因变异的如表皮生长因子受体（EGFR）突变、间变性淋巴瘤激酶（ALK）重排、ROS1重排的非小细胞肺癌患者具有很好的治疗效果，能够极大地延长患者的生存期及改善生存质量。在这些驱动基因中，EGFR基因突变约占所有基因变异的一半以上，目前EGFR基因突变检测已经成为临床靶向药物选择的一个关键因素。EGFR突变的患者在经过EGFR-TKI药物治疗后，多数患者会在1-2年内出现耐药。研究表明，耐药发生的机制包括EGFR基因TM突变、MET基因扩增、HER2基因扩增及一些旁路信号通路的激活等。在所有的耐药机制中EGFRTM突变占50%-60%。因此，及时检测EGFR-TKI治疗耐药后患者是否发生了TM突变对于临床治疗策略的选择至关重要。而对于无法获得或难以获得肿瘤组织的患者，血浆游离肿瘤DNA可以作为二次基因检测的良好样本来源。近些年，以血液等为样本基础的液体活检技术飞速发展，通过血浆游离DNA（cellfreeDNA,cfDNA）检测EGFR等基因突变具有显著优势，并在一定程度上有效克服肿瘤异质性，可实现无创实时动态检测。检测血浆游离DNAEGFR基因TM突变的方法
由于血浆游离DNA的含量低，需要灵敏度较高的检测方法来检测TM是否发生突变。ARMS法具有操作方便、耗时短等优势，但是仅能实现相对定量且检测的灵敏度只有0.2%。因此当血浆游离DNA中EGFRTM突变的丰度较低时，会造成一定的假阴性，使一部分患者EGFRTM耐药突变被漏检。数字PCR法（digitalPCR，ddPCR）可以实现绝对定量，灵敏度也更高，检测血浆游离肿瘤DNA时灵敏度可以达到0.01%。MALDI-TOFMS、克隆杂交法及NGS除能对TM突变定性检测外，还能对其进行定量检测。目前，能够进行TM突变定量的检测技术应用最多的为Super-ARMS，ddPCR和NGS法。EGFR-TKI抑制剂治疗耐药后血浆游离DNAEGFR基因TM突变的临床意义
EGFR-TKI治疗前、疾病进展后以及治疗过程中检测TM突变其临床意义不尽相同。治疗前对患者肿瘤组织进行TM检测可以预测EGFR-TKI的疗效。研究发现，治疗前同时发生EGFRLR突变或19外显子缺失及TM突变患者的无进展生存期显著低于仅发生LR突变或19号外显子缺失患者，但优于不存在上述突变患者，故该研究认为原发TM突变是EGFR-TKI疗效的不良预测因子。相比定性检测，定量检测TM突变能更精确指导临床，在使用EGFR-TKI治疗前伴TM突变患者中，高丰度组比低丰度组有着更短的无进展生存期及总生存期，提示治疗前TM的突变丰度与EGFR-TKI疗效及预后相关。疾病进展后检测TM突变有助于了解EGFR-TKI的耐药机制，为制订克服耐药策略提供依据。目前针对TM靶点的第三代EGFR-TKI，如AZD、CO-、HM等药物快速涌现，疾病进展后TM突变状态与生存的关系正在探索中，Oxnard等[1]的研究显示，发生耐药TM突变阳性患者的进展后生存期显著长于无TM突变患者。因此，治疗后TM突变尽管是EGFR-TKI的耐药原因，但也可能是进展后生存良好的预后因子。在EGFR-TKI治疗期间连续动态检测血浆TM突变状态，可以为预测疗效、监测耐药提供更多信息。Oxnard等[1]报道了在EGFR敏感突变患者中血浆连续检测TM突变与影像学肿瘤变化的关系，发现血浆TM突变在影像学疾病进展的16周前已经出现，提示在EGFR-TKI治疗过程中动态监测TM基因状态有可能预测耐药，不仅可以指导晚期NSCLC患者的治疗，而且有助于探究TM突变诱导的耐药机制及其异质性。EGFR-TKI抑制剂治疗耐药后血浆游离TM突变患者的临床病理特征
TM阳性率在19外显子缺失的患者中较LR突变的患者中更高
研究发现TM阳性在19外显子缺失较LR更易发生（60．3%vs．37．9%，P＜0.01）[2]。根据Kobayashi等人和Pao等人关于EGFR-TKIs获得性耐药的研究发现TM突变是因为在位(TM)甲硫氨酸取代苏氨酸，而LR突变是因为21外显子编码的第个氨基酸中mRNA的第位密码子T置换为G使得编码氨基酸由亮氨酸变成了精氨酸，引起EGFR下游通路的激活导致肿瘤的发生。综上所述这两者均属于错义突变，而19外显子突变是属于缺失突变[3，4]。因此有人推测这种分子改变是LR突变可能更易发生TM突变原因。而在EGFR-TKIs耐药中最常见的是TM突变，所以LR突变治疗后出现TM突变是肯定的。使用erlotinib更易发生TM突变
研究表明使用不同的EGFR-TKI药物治疗后，患者发生TM的概率并不相同。相较于afatinib，使用erlotinib后患者更易发生TM的突变。研究显示afatinib和erlotinib的TM突变率的范围分别为3.4%到33%，25.9%到58%，但尚无统计学差异。组织和血浆检测TM突变的一致性
在一项纳入了例患者的研究中，研究者发现用组织和血浆检测TM突变状态其特异性和灵敏度分别为69%和70%。在chia．chi研究中，对18个发生EGFR-TKI耐药的患者进行了组织和血浆配对的二代测序检测，发现组织和血浆的一致率可达92%[5]。但是在实际检测操作过程中，各步骤的规范化处理与否对检测质量影响巨大。因此TM血液检测与组织检测可相互补充验证，避免假阴性结果，提高检出率，使患者获益。ARMS方法和ddPCR方法检测血浆EGFRTM突变的一致性
Wang等通过用ARMS和ddPCR对比75例非小细胞肺癌获得性耐药患者的循环肿瘤DNATM突变情况，结果显示ddPCR法对TM的检出率为46.7%（35/75），大于ARMS法对TM的检出率25.3%（19/75）[6]。来自同济大医院病理科的曹紫阳等同时用ARMS和ddPCR方法检测37例EGFRTKI耐药患者血液中TM的突变，Super-ARMS法检测出13例EGFR基因TM突变，检出率为35.1%；ddPCR法检测出17例突变，突变检出率为45.9%[7]。这些结果显示ddPCR检测血浆TM突变灵敏度明显高于Super-ARMS。小结
近年来，随着精准诊疗成为肿瘤诊疗热点，针对肺癌的驱动基因研究也取得飞速进展。精准的基因诊断能够为肺癌患者的靶向治疗指明方向，使患者得到最大程度的靶向治疗获益。然而，目前临床上最常用的基因诊断材料依然是肿瘤组织（如活检组织或者细胞学标本）。而肿瘤组织获取困难，同时其取材易受到肿瘤异质性影响，因此难以利用活检组织在疾病进程中实现对基因变异状态的动态监测。随着三代EGFR-TKI药物奥希替尼在TM突变的肺癌患者中的应用，对奥希替尼耐药的患者也陆续出现，血浆游离DNA检测发现与TM顺式的CS突变为最常见的三代TKI药物耐药原因。液体活检作为一种新兴检测方法，由于其非侵入性、方便、快捷及利于动态监测的优点，展示出了极大的发展潜力，已成为组织检测的有力补充。参考文献
1.OxnardGR,HuY,MilehamKF,etc．AssessmentofResistanceMechanismsandClinicalImplicationsinPatientsWithEGFRTM—PositiveLungCancerandAcquiredResistancetoOsimertinib[J]．
2.JooJW,HongMH,ShimHS．ClinicalcharacteristicsofTM-positivelungadenocarcinomaafterresistancetoepidermalgrowthfactorreceptor-tyrosinekinaseinhibitorswithanemphasisonbrainmetastasisandsurvival[J]．LungCancer．．：12-17．
3.HoCC，LiaoWYLinCA，etc．AcquiredBRAFVEMutationasResistantMechanismafterTreatmentwithOsimertinib[J]．JThoracOnc01．．12(3)：-．
4.PlanchardD,SmitEF,GroenH,etc．DabrafenibplustrametinibinpatientswithpreviouslyuntreatedBRAF(VE)-mutantmetastaticnon-small-celllungcancer：anopen-label,phase2trial[J]．LancetOnc01．．18(10)：-．
5.LinCC，ShihJY,YuCJ，etc．Out