研究背景：
非小细胞肺癌(NSCLC)是全球肿瘤相关死亡的主要原因，其发病率在过去几十年中稳步上升。化疗是晚期非小细胞肺癌的主要治疗手段，但交叉耐药和副作用的出现限制了化疗的疗效。因此，人们正在探索新的辅助治疗策略，以提高化疗药物的疗效，降低化疗药物的*性。铁死亡是一种依赖铁和脂质过氧化的程序性细胞死亡亚型，它涉及一系列独特的形态学、生化和遗传学特征，不同于凋亡、自噬和坏死。铁死亡可在多种肿瘤细胞中诱发，如肺癌和乳腺癌。然而，以前的研究人员发现多种肿瘤细胞对erastin不敏感，作者之前的研究发现A和H细胞对erastin诱导的铁死亡不敏感。因此，迫切需要寻找能够增强A和H细胞对Erastin敏感性的药物。已有研究表明，erastin和对乙酰氨基酚(APAP，一种替代阿司匹林的解热镇痛药)诱导黑色素瘤细胞死亡的机制与erastin诱导的铁死亡(ROS过量产生和细胞内GSH降低)相似。因此，作者推测erastin联合APAP可以增加NSCLC细胞对铁死亡的敏感性。
研究思路：
首先，作者探讨了Erastin和/或APAP诱导的NSCLC铁死亡。为了探讨Erastin和/或APAP诱导的NSCLC铁死亡，作者分别用MTT法检测了A和H细胞的细胞活力损失。MTT结果显示，Erastin或APAP均以剂量依赖方式诱导A和H细胞死亡。与单独使用Erastin或APAP相比，Erastin/APAP显著增加细胞死亡(图1a，b)。用Chou-Talalay法计算Erastin/APAP对A和H细胞的联合指数(CI)值，发现不同Erastin/APAP比例(图1c)有协同作用，Erastin/APAP比例为1：8时协同作用最佳(图1D)。Erastin/APAP对H细胞活力的抑制作用强于对A细胞的抑制作用。流式细胞仪(FCM)进一步证实了协同抑制活性(图1e)，细胞形态变化也证实了这一点(图1f)。总而言之，这些发现表明，erastin与APAP诱导的显著细胞死亡具有协同作用。在Fer-1或DFO存在下，erastin和APAP诱导的细胞死亡明显减轻，表明erastin和APAP共同处理可诱导亚铁离子依赖性铁死亡(图1g，h)。Caspase抑制剂Z-VAD-FMK也能减轻erastin和APAP引起的细胞活力下降，表明细胞凋亡可能参与erastin/APAP诱导的细胞死亡(图1g，h)。
为了进一步揭示ERASTIN和APAP对细胞增殖的协同作用，作者进行了EDU实验和集落形成实验。经20μm/ml的Erastin和μm/ml的APAP处理24小时后，与Erastin相比，联合处理的EDU阳性细胞数明显减少(图2a)，表明联合处理对DNA合成的抑制作用更强。克隆形成实验显示，联合处理也显著限制了细胞的增殖能力(图2b)。共聚焦显微镜观察细胞内微丝分布。完整细胞呈现出连续的长线状微丝分布模式，而经erastin/APAP处理的细胞微丝网络转变为无定形的短线状，经erastin/APAP处理的细胞微丝完全变形(图2c)。
亚铁催化产生特定的ROS，这是导致铁死亡的主要原因。接着，作者评估了Erastin和/或APAP诱导的癌细胞内亚铁离子的变化。在A和H细胞中加入Erastin或APAP可明显上调A和H细胞内的亚铁含量(图3a，b)。DFO和Fer-1显著抑制Erastin/APAP诱导的细胞内亚铁的增加(图3c)。
铁死亡的细胞*性依赖于ROS的产生。因此，作者又测量了经erastin和/或APAP处理后A和H细胞中ROS的产生。细胞单独用erastin处理12小时后，A和H细胞ROS生成分别增加%和%(图4a，b)，Erastin/APAP处理后ROS生成分别显著增加到%和%(图4a，b)。DFO有效地抑制了erastin/APAP引起的ROS的产生(图4c)。在A和H细胞中，Fer-1也抑制ROS的积累(图4d)。同时，荧光显微镜观察结果与上述结果一致(图4E)。上述结果提示，ROS的产生在Erastin/APAP诱导的细胞死亡中起重要作用。脂质过氧化的最终产物丙二醛(MDA)被检测为铁死亡的关键事件。24小时后，Erastin或APAP使MDA升高，Erastin和APAP共同处理导致MDA升高(图4f)。在DFO或Fer-1存在下，Erastin/APAP诱导的MDA生成明显受到抑制(图4f)，表明APAP的加入显著增强了Erastin诱导的脂质过氧化。鉴于谷胱甘肽在氧化损伤修复中的重要作用，作者评估了Erastin和/或APAP处理后A和H细胞内的GSH水平。24小时后，ERASTIN或APAP显著降低GSH，当ERASTIN和APAP联合处理细胞时，这种下降加剧(图4G)。FER-1和NAC(乙酰半胱氨酸，GSH的生物合成前体)处理挽救了erastin与APAP联合导致的GSH水平下降(图4G)，强调了GSH下降促进了erastin与APAP协同作用后的铁死亡。
线粒体体积减少和膜密度增加是Erastin诱导的铁死亡的显著形态学特征。于是，作者对线粒体的形态学特征进行观察。作者发现经erastin和/或APAP处理的A和H细胞线粒体膜密度增加，体积减小(图5a)。细胞核大小正常，有染色质边集和凝集(图5a)。这些结果提示，联合处理引起的细胞死亡参与了线粒体介导的铁死亡和细胞凋亡的合成特征。有证据表明线粒体ROS的产生依赖于ΔψM。荧光强度显示，经Erastin或APAP处理的细胞表现出JC-1单体的高积累(绿色荧光)和JC-1聚集体的低积累(红色荧光)，且Erastin/APAP组的绿色荧光与红色荧光的比率在A细胞中最高(图5b，c)。提示ERASTIN联合APAP可导致ΔψM丢失和线粒体功能障碍。同时，Fer-1处理阻碍了ΔψM的变化，这一点从Jc-1聚集体的增加中得到了明显的证实(图5b)。C/EBP同源蛋白(CHOP)是内质网应激的典型生物标志物；经erastin和APAP联合处理后，CHOP的表达增加(图5d)。
Nrf2通过刺激Nrf2介导的内源性抗氧化剂的表达，降低ROS水平，在一定程度上促进了肿瘤细胞的增殖。因此，作者研究了Erastin诱导的铁死亡过程中Nrf2的激活，以确定Nrf2在Erastin和APAP诱导的铁死亡中的作用。erastin和/或APAP处理6小时导致Nrf2核移位。然而，在24小时，APAP中Nrf2的核转位减弱(图6a)。Westernblot结果证实了Nrf2核转位的改变(图6b)。甲基巴度考酮(BM)激活Nrf2可显著抑制Erastin/APAP诱导的A细胞生长抑制(图6c)。HO-1是受Nrf2调控的AREⅡ期解*酶和抗氧化剂之一。QRT-PCR和Westernblot结果显示，经erastin和APAP、BM共同处理后，细胞中HO-1的表达降低，BM可以挽救HO-1的表达(图6d，e)。
为了评价erastin和APAP对非小细胞肺癌(NSCLC)的体内杀伤作用，作者用erastin和/或APAP治疗裸鼠肺癌皮下移植瘤。如图7a所示，肿瘤生长抑制从第1-15天开始，erastin/APAP对肿瘤生长有明显的抑制作用。各组之间的体重差异并不显著(图7b)。联合治疗组移植瘤重量明显小于APAP组和Erastin组(图7c)。此外，Erastin或/和APAP处理也导致丙二醛的过量产生和谷胱甘肽的减弱(图7d，e)。如图7f所示，经erastin/APAP处理后出现更多的死亡细胞，而erastin或APAP组仅有中度细胞死亡。HE染色组织切片显示，给药剂量对器官(心、肝、脾、肺和肾)无损害(图7f)。免疫组织化学染色显示，Erastin处理组移植瘤细胞核内Nrf2表达增强，但与Erastin和APAP联合处理后，Nrf2在细胞核内的分布减少(图7f)。
结论:
erastin和APAP联合治疗可导致铁死亡，包括脂质过氧化产物过度生成、线粒体稳态失调和抑制Nrf2/HO-1氧化还原调节。总之，erastin和APAP联合治疗为肺癌的铁死亡诱导提供了一种新的策略。
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