一、摘要
Auranofin(AF)是FDA批准的具有抗癌特性的抗风湿药物，作为硫氧还蛋白还原酶1(TrxR)抑制剂。房颤靶向癌细胞的确切机制仍不清楚。为了阐明作用模式，本研究对非小细胞肺癌细胞系NCI-H(p53空)及其两个突变型p53RH或RH积累的同基因衍生物中房颤介导的细胞*性的分子机制和免疫原性进行了深入分析。
TrxR在72名非小细胞肺癌患者中高度表达，使其成为非小细胞肺癌房颤的有效药物靶点。突变p53过表达的存在被确定为(同基因)非小细胞肺癌细胞中房颤的重要敏化剂，因为它与体外硫氧还蛋白(Trx)水平降低相关。转录组分析揭示了与氧化应激反应、DNA损伤、颗粒酶A(GZMA)信号传导和铁死亡有关的基因失调。虽然功能性房颤在所有NCI-H细胞系中似乎是GPX4的有效抑制剂，但脂质过氧化的诱导和由此导致的铁死亡仅限于p53RH表达细胞。在p53RH细胞中，房颤主要诱导大规模的DNA损伤和复制应激，导致细胞凋亡而不是铁死亡。重要的是，所有细胞死亡类型都是免疫原性的，因为危险信号(外钙网蛋白、三磷酸腺苷和HMGB1)的释放和树突细胞的成熟与(突变)p53的表达无关。最后，此研究表明房颤通过下调GZMA的几个关键靶点使癌细胞对胱天蛋白酶非依赖性自然杀伤细胞介导的杀伤敏感。
此研究的数据通过独特的细胞死亡机制(凋亡和铁死亡)靶向突变p53癌细胞，为房颤作为一种有效的临床可用的非专利癌症药物提供了新的见解。此外，房颤在细胞抑制(自然杀伤细胞介导的杀伤)和细胞*性浓度(树突细胞成熟)下均可改善先天免疫反应。
二、结果
1.TrxR作为非小细胞肺癌潜在的药物靶点
由于Trx系统与许多癌症有关，作者使用公开的TCGA数据库确定了肺腺癌(LUAD)队列中Trx抗氧化途径成员的基因表达几乎都存在于LUAD患者的基因水平(图1A)。此外，TXN、TXNRD1、PRDX4和PRDX6基因的高表达与LUAD患者的预后相关(图1B)。
在蛋白质水平上进行IHC分析以评估72例非小细胞肺癌腺癌患者中TrxR的表达(图1C–E，补充表4-5)。在95.8%的非小细胞肺癌组织中检测到TrxR蛋白，在本研究患者群体的所有阶段均有不同的表达(图1D，补充表4)。在非肿瘤性肺组织中有检测到TrxR(补充表4)。但并未发现TrxR与任何临床病理特征之间的显著关联(补充表5)，单变量生存分析表明，TrxR不是更差的OS或PFS的显著预测因子(图1E)。总的来说，Trx在非小细胞肺癌患者的基因和蛋白质水平上都有表达，表明TrX/TrX系统是非小细胞肺癌房颤的有效药物靶点。
图1
2.突变型p53积累使非小细胞肺癌细胞系对房颤治疗敏感
作者的主要焦点是在非小细胞肺癌腺癌，但本研究还包括了PDAC细胞系，以确定房颤是否可以作为一种肿瘤不可知的治疗，具有更广泛的应用范围。剂量反应存活曲线及其相应的IC50值显示对房颤的敏感性不同，野生型p53细胞系A是最不敏感的(图2A和B)。其他细胞系之间反应的强烈可变性表明，仅TP53突变状态不能解释对房颤的敏感性。分析p53蛋白水平时，发现在非小细胞肺癌和PDAC细胞中房颤IC50值呈负相关(图2C–E，补充图1和2)。这表明高水平的突变p53蛋白使癌细胞对房颤敏感。
由于TrxR的抑制会导致ROS水平的增加而调节细胞内氧化还原状态，作者尝试研究房颤治疗中潜在的抗氧化相关生物标志物。TCGA数据库的数据显示了名LUAD患者中不同抗氧化相关基因的表达(补充图3)。此外，测定了这些抗氧化剂相关蛋白的基线水平，并与八种非小细胞肺癌和PDAC细胞系的房颤IC50值相关联(图2D和E，补充图1和2)。高水平的NRF2与较高的房颤IC50值呈正相关，而Trx没有观察到其和SLC7a11显著的相关性(图2E，补充图1)。此外，在突变型p53表达水平和其它抗氧化相关蛋白的表达之间没有发现显著的相关性(图2D和E，补充图1)。
为验证这些发现，作者使用了同基因突变型p53非小细胞肺癌NCI-H细胞组(图2F-H，补充图4)。与RH细胞相比，其显示出明显更高水平的突变p53蛋白(图2F，补充图4A和B)，并且对房颤最敏感(图2G，补充图4C)。其还含有中等水平的突变p53蛋白，随后具有更高的AFIC50值(图2F和G，补充图4A和B)。关于抗氧化相关蛋白，作者发现在突变型p53表达细胞中，Trx蛋白水平明显较低(图2H)，为进一步确定还用额外的抗Trx抗体验证(图2H，红色标记)。此外，这两种都具有较低的SLC7A11蛋白水平(补充图)。与p53空细胞和p53RH细胞相比，RH细胞系中的GPX4水平显著更高(补充图4D)。
但是在本研究中，并非所有的TP53突变患者都表现出突变P53蛋白的异常过表达，这表明表达水平不是区分WT和突变p53肿瘤的有效标志(补充图5-6；补编表6)。
总之，我们发现p53蛋白在非小细胞肺癌中的表达水平是体外房颤治疗敏感性的决定因素。
图2
补充图1
补充图2
补充图3
补充图4
补充图5
补充图6
3.房颤治疗使非小细胞肺癌细胞的转录组向抗氧化防御、脱氧核糖核酸损伤修复和铁死亡诱导方向重组
为验证房颤作为TrxR抑制剂和氧化应激介质的作用，我们使用细胞抑制(1μm)和细胞*性(5μm)浓度检测了其对TrxR活性和GSH含量的剂量依赖性影响。培育6小时后，两种浓度的房颤都使TrxR活性完全耗尽(图3A)。用1μm房颤处理6小时不会显著改变GSH含量，但延长24小时会导致GSH显著增加。这很可能代表了平衡受干扰的氧化还原状态的反机制(图3B)。在5μm时，房颤在6小时后显著降低细胞内GSH蛋白，24小时后无活细胞出现(图3B)。而p53蛋白水平没有观察到差异。
为进一步阐明房颤在突变型p53非小细胞肺癌中的作用模式，我们在用1μm(细胞抑制)房颤治疗24小时后，在等基因NCI-H细胞系组中进行了鸟枪法转录组分析。IPA显示NRF2介导的氧化应激反应是所有三种细胞系中受房颤影响的最重要的信号途径，与p53蛋白水平无关(图3C)，其中HMOX1是差异表达最强的基因(图3D)。蛋白质印迹证实了房颤介导的HMOX1、NRF2和另外两个抗氧化相关基因TXN和SOD1的上调(图3E)。与1μm的细胞抑制浓度一致，G2/MDNA损伤检查点调节是第二大受影响的途径(图3C和D)。
随着GSH含量的增加(图3B)，几个GSH生物合成相关基因被上调(图3D)。在房颤治疗后，蛋白质水平证实GPX4基因是所有三种细胞系中唯一显著下调GSH途径的基因(图3D和E)。GPX4活性降低是铁死亡的关键特征之一，与HMOX1、FTH1和FTL基因的上调密切相关，因为它们都与铁稳态信号和铁死亡途径有关。
IPA分析还显示GZMA信号通路受到房颤治疗的高度影响，在p53RH突变细胞中效果最强(图3C和D)。GZMA是细胞*性T淋巴细胞和NK细胞的细胞*性颗粒中最丰富的丝氨酸蛋白酶。在突变型p53RH细胞的存在下，GZMA的几个关键靶标被显著下调(图3D，补充图7)。作者假设房颤治疗可以增强突变p53非小细胞肺癌细胞对自然杀伤细胞介导的杀伤的敏感性，这是通过释放含有GZMA的细胞*性颗粒来实现的。
由于Trx和GSH系统的抑制(图3A和B)导致氧化还原平衡的扰动和ROS水平的增加(图4D)，接下来研究了NCI-H细胞系是否更容易在房颤治疗时发生DNA损伤。在所有三种细胞系中观察到复制应激(pRPA32)和总DNA损伤(γH2AX)的剂量依赖性诱导(图3F和G，补充图8)。作者发现了明显的p53依赖性差异，因为在房颤治疗的突变型p53RH细胞中，γH2AX的积累明显高于空细胞和RH细胞(图3F，补充图8)。
图3
补充图8
4.房颤通过不同的细胞死亡途径杀死突变型p53非小细胞肺癌细胞
脱氧核糖核酸损伤是细胞死亡的触发因素，转录组分析表明涉及铁转运途径。为确定房颤诱导的细胞死亡的分子决定因素，作者使用了一组特定的细胞死亡途径抑制剂。在没有抑制剂的情况下，突变型p53过表达对房颤诱导的细胞死亡的增敏作用被概括为p53RH和p53RH细胞系与p53空细胞相比细胞死亡增加了2倍以上(图4A-C，补充图9)。与活性氧清除剂NAC的共同处理完全保护所有细胞系免受房颤诱导的细胞死亡，支持活性氧在细胞死亡诱导中的驱动影响(图NAC)。事实上，通过对细胞内ROS水平的定量分析显示，所有细胞在房颤治疗后活性氧水平均增加(图4D)。但是细胞死亡仅在p53RH细胞中被泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK显著减少，而铁死亡抑制剂(Fer1，DFO，α-生育酚)部分抑制p53RH细胞死亡(图4B和C)。RH细胞系中胱天蛋白酶3/7活性的显著较高的诱导(图4E和F)和RH细胞系中脂质过氧化的特征性诱导(图4G和H)证实了两种细胞系都通过不同的途径死亡，即RH细胞系的凋亡和RH细胞系的缺铁。
基于对核糖核酸序列数据的主成分分析，突变型p53RH细胞和p53空细胞与突变型p53RH细胞分开聚集，具有高度的差异，反映了表型基线特征的差异(补充图10)。如前所述，根据我们对该细胞系可使细胞对房颤治疗敏感的假设，与RH细胞系(图2F，补充图4A和B)相比，RH细胞还表达显著更高水平的突变p53。但是作者还不认为这解释了细胞死亡机制的差异。作者假设RH细胞的间充质样状态使其对铁死亡细胞死亡敏感，因为可以靶向GPX4或调节GSH水平的铁死亡诱导剂能够消除间充质癌细胞的耐药性。然而对本研究的GSEA表明，EMT特征基因在p53RH细胞中没有比p53空细胞或p53RH细胞富集(补充图11A)。此外，与p53RH细胞相比，RH细胞没有表现出更高的迁移和侵袭能力(补充图11B–D)。最近报告表明，ZB1，一种通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)调节EMT和细胞脂质代谢的调节剂，与高间质状态细胞的脂质过氧化物易感性和GPX4依赖性有因果关系。与这些发现一致，GPX4蛋白水平在RH细胞中显著更高(补充图4D)；与RH和空细胞相比，ZB1、PPARG、CDH2(N-钙粘蛋白)的表达水平上调，CDH1(E-钙粘蛋白)的表达下调(补充图11E)。此外，NCI-H细胞系含有相同的突变p53RH蛋白，但被归类为与其EGFR突变相关的上皮细胞。与我们的假设一致，铁死亡抑制剂未能从房颤诱导的细胞死亡中挽救NCI-H细胞，房颤诱导的细胞死亡是通过胱天蛋白酶依赖性凋亡而起作用的(补充图12A-B)。
图4
补充图9
补充图12
5.房颤诱导突变型p53非小细胞肺癌细胞系免疫原性细胞死亡
ICD病的特征是死亡的肿瘤细胞表达和释放抑癌基因蛋白，其功能是作为佐剂或危险信号激活树突状细胞并启动有效的抗肿瘤免疫反应。因此，接下来在同基因NCI-H细胞系组中研究了房颤诱导的细胞死亡的免疫原性潜力。在所有三种细胞系中，细胞*性浓度的房颤(2μm)显著诱导典型抑制，包括体外CALR的表面暴露(图5A，补充图13)、三磷酸腺苷的分泌(图5B)和HMGB1向上清液的释放(图5C)。我们检查了这些是否反过来触发了DC成熟来建立有效的适应性免疫反应。事实上，我们观察到成熟CD86+/MHC-II+DC群体(图5D和E，补充图14)，其中两种标记物的表达水平强烈增加(补充图15)，而不诱导DC介导的对NCI-H肿瘤细胞的细胞*性(补充图16)。由于树突状细胞的成熟与促炎和免疫抑制细胞因子产生的变化有关，所以分析发现树突状细胞和房颤处理的同基因细胞之间的相互作用显著降低了肿瘤坏死因子-α(图5F)、白细胞介素-6(图5G)和TGF-β(图5H)的释放，与(突变)p53表达水平无关。结合上述，这些体外结果表明，房颤治疗诱导ICD和DC成熟最重要特征的释放，独立于(突变)p53表达或细胞死亡途径，并抑制细胞因子的释放。
图5
6.房颤激发突变p53非小细胞肺癌细胞进行白介素-15刺激的自然杀伤细胞介导的杀伤
转录组分析显示房颤下调GZMA的关键靶点(HMGB2、ANP32A和接头组蛋白H1；图p53RH和RH细胞系中的3C和D。这些目标在GZMA通过NK细胞诱导的核损伤中起着关键作用。因此，我们假设房颤治疗可以增强突变p53非小细胞肺癌细胞对自然杀伤细胞介导的杀伤的敏感性，这种杀伤是通过释放含有GZMA的细胞*性颗粒来实现的。为了测试这一点，作者将同基因NCI-H细胞与白介素-15引发的自然杀伤细胞(10ng/ml)共培养。在这种情况下，非小细胞肺癌细胞暴露于无*剂量(0.55μm)的房颤显著增加细胞死亡，尤其是p53RH细胞(图6A和B)。与颗粒酶B相反，GZMA通过其特有底物和介质激活胱天蛋白酶非依赖性程序性细胞死亡。当通过Z-VAD-FMK显著阻断半胱天冬酶依赖性细胞死亡时(图6C)，与未阻断条件相比，AF处理的RH细胞的NK细胞介导的杀伤没有显著降低(图6D)。这些数据表明半胱天冬酶非依赖性GZMA在增强房颤治疗的NCI-H细胞杀伤中的潜在作用。
为进一步阐明房颤+白介素-15联合自然杀伤细胞增加突变p53非小细胞肺癌细胞杀伤的潜在机制，我们考虑房颤治疗是否刺激了自然杀伤细胞的活化，或者使肿瘤细胞更容易受到自然杀伤细胞介导的杀伤，这与作者的GZMA依赖假说(图6E和F，补充图17和18)一致。白细胞介素-15是一种已知可增加自然杀伤细胞增殖和活化的细胞因子(补充图18A–C)。由于细胞内GZMA的表达存在于整个自然杀伤细胞群中(补充图18C)，白介素-15刺激和房颤治疗对这种表达的影响是有限的(补充图18A–C)。重要的是，房颤治疗没有显著改变任何标记物在未刺激(图6E)或IL-15刺激(图6F)的NK细胞上的表达，表明房颤对NK细胞的功能和活化作用有限。
为扩大房颤诱导的对自然杀伤细胞介导的杀伤的敏感性的适用性，还包括了一个额外的野生型p53非小细胞肺癌细胞系(A)和两个突变型p53PDAC细胞系(MiaPaca和BxPC3)(补充图19)。与p53空非小细胞肺癌细胞相比，房颤治疗不影响自然杀伤细胞介导的野生型p53A细胞的杀伤。另一方面，表达突变p53的PDAC细胞MiaPaca和BxPC3暴露于房颤增加了NK细胞介导的肿瘤细胞杀伤(补充图19)。
总之，房颤诱发突变型p53非小细胞肺癌通过白细胞介素-15刺激自然杀伤细胞进行杀伤，而不影响自然杀伤细胞的活化、脱粒或细胞内GZMA的表达。
图6
三、结论
作者证明了房颤通过不同的分子机制根除非小细胞肺癌细胞的高效性，包括由突变型p53蛋白过度表达引起的凋亡和凋亡细胞死亡。不考虑(突变)p53的表达，两种细胞死亡机制均导致体外树突状细胞凋亡和成熟的显著增加。此外，AF引物突变p53表达非小细胞肺癌细胞通过下调GZMA的几个关键靶点进行胱天蛋白酶非依赖性NK细胞介导的杀伤，而不影响NK细胞活化、脱粒或细胞内GZMA表达。总之，此研究为房颤介导的细胞死亡的潜在机制及其对p53突变非小细胞肺癌先天免疫反应的积极作用提供了新的体外数据，支持其作为一种多功能抗癌剂的应用。
Thankyou！
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